TECNICAS

REACTIVO:

—  Reactivo de color de Sodio:

—  Solución de acetato  de uranilo, 5.3g/dL y acetato de zinc 15.4g/dL, en solución acuosa ácido acético-etanol.

—  Reactivo precipitante.

—  Solución acuosa de Acido tricloroacético (TCA), 10g/dL.

—  Estándar de sodio.

—  Cloruro de sodio,4.091 g/L, en solución TCA. Equivalente a un

—  valor de sodio de 140mmoI/L cuando se utiliza como se indica en éste método.

—  Materiales requeridos pero no proporcionados.

—  Espectofotrómetro

—  Centrifuga con alta capacidad de velocidad (>1500 rpm)

—  Pipetas exactas de 0.5 y 2.5 mL.

—  Tubos de prueba y celdillas, Agitador Vortex, Cronómetro.

—  Recolección y Preparación de la Muestra.

—  Suero: Remueva del coágulo pronto y con cuidado para evitar la

—  hemólisis.

—  Plasma: Utilice como anticoagulante heparina de litio, heparina de amonio u oxalato de litio.

—  Orina: Diluya una porción de orina de 24 horas 1:10 (1+9) con

—  agua destilada. Dependiendo del contenido de sodio, se puede

—  requerir una dilución de 1:5 (1+4) ó 1:2 (1+1).

Procedimiento.

—  Preparación del sobrenadante libre de proteínas.

—  1. Añada 0.5 mL de suero, plasma u orina diluida a tubos adecuadamente marcados.

—  2. Añada 0.5 mL del Reactivo Precipitante gota a gota a cada tubo con agitación vigorosa (se sugiere usar vortex).

—  3. Déjelo reposar por 5 minutos, después centrifugue a alta velocidad por 5 – 10 minutos.

Procedimiento.

—  1. Pipetee en los tubos marcados los siguientes volúmenes (mL), agitando rápidamente después de cada adición del reactivo de Color.

—  3. Incube los tubos por 10 minutos a temperatura ambiente 288-298 K (15– 25 °C).

—  4. Después del periodo de incubación, mezcle fuertemente y centrifugue a alta velocidad por 5 minutos.

—  5. Transfiera con cuidado el sobrenadante de cada tubo a la celdilla apropiada.

6. Con el espectrofotómetro a 420 nm calibre a cero el instrumento con agua. Lea y registre la absorbancia del blanco de Reactivo (RB), del Estándar (s) y de la Muestra (U) en 30 minutos

Control de calidad:

—  Se debe incluir en cada serie de ensayos un suero control y/u orina analizado para el contenido de sodio por este método, fotometría de flama, o electrodo ión-selectivo.

—  Para esta prueba se recomienda correr los controles Ser-T-Fy I y

—  II de Stanbio.

Resultados.

—  Lo valores se derivan del siguiente cálculo:

—  Sodio en suero, plasma u orina (mmoI/L)=

—  Abs(RB) – Abs(U) X 140

—  Abs(RB) – Abs(S)

—  Donde Abs (RB), Abs (U) y Abs(S) representan las absorbancias del Blanco de reactivo, Muestra y Estándar respectivamente, y 140 es el valor equivalente del estándar de sodio en mmoI/L.

Calcio (Ca)

Prueba Fotocolorimétrica para Calcio

Método: Los iones de Calcio reaccionan con o-cresolftaleina-complexona , en un medio alcalino, para formar un complejo de color púrpura. La absorbancia de este complejo es directamente proporcional a la concentración de calcio en la muestra

—  CONTENIDOS

BUF      100 ml de solución Buffer          0.2mol/l

              Buffer lisisna (pH 11.1)              

              Azida de Sodio )                          0.095%

RGT      100 ml de reactivo de color        14mmol/l

              8-hidroxina                                 0.1mmol7l

              o-cresolftaleína-complexona    50mmol/l

              Ácido clorhídrico

STD      3 ml estándar

              Calcio II                        8mg/dl o 2mmol/l

              Azida de Sodio                                 0.095%

—  Preparación de los reactivos: Añadir RGT a un volumen igual de BUF según se requiera, mezclar y dejar reposar por 30 min.  A temperatura ambiente antes de su uso.

—  Muestra: Suero o plasma heparinizado.

ESQUEMA DE PIPETEO:

TECNICA DEL POTASIO

El método presentado para la determinación de potasio se basa en la técnica turbidimetrica publicada por Hillman y Beyer en 1967. Los resultados coincidían favorablemente con aquellos obtenidos por fotometría de flama y fueron adecuados para la detección rápida de híper e hipokalemia en ausencia de un fotómetro de flama o electrodo ion-selectivo. Los iones potasio en un medio alcalino libre de proteínas reaccionan con el tetrafenilborato de sodio para producir una suspensión turbia finamente dispersa de tetrafenilborato de potasio. La turbidez producida es proporcional a las concentraciones de potasio.

REACTIVOS

-Reactivo de borato de potasio.

Solución acuosa de tetrafenilborato de sodio, 0.2 moI/L

-Reactivo de hidróxido de Sodio.

Hidróxido de sodio acuoso, 2.0 moI/L

-Reactivo de TCA Precipitante.

Solución acuosa de ácido tricloroacético (TCA) 0.3 moI/L

-Estándar de Potasio (Equivalente a 4.0 mmoI/L).

Solución de cloruro de potasio en TCA acuoso (0.3 moI/L)

MATERIAL REQUERIDO

*Espectrofotómetro

*Centrifuga

*Pipeta automática

*Vasos graduados, probetas o pipetas.

*Tubos de prueba o celdillas

PROCEDIMIENTO

Preparación del sorbrenadante de libre de proteínas.

1. Añada 0.05 mL de suero, plasma u orina diluida a tubos

Previamente etiquetados.

2. Añada 0.5 mL de Reactivo TCA precipitante gota a gota a

Cada tubo mezclado vigorosamente (de preferencia utilizar

vortex).

3. Déjelo por 5minutos, después centrifugue a alta velocidad por

5 – 10 minutos.

Procedimiento de la prueba

1. Añada el estándar o el sobrenadante claro en la mitad de la superficie del reactivo de trabajo, asegúrese que cada celdilla sea mezclada con cuidado antes de proseguir con la siguiente muestra, de acuerdo al siguiente esquema:

Nota: Puede utilizar todos los volúmenes al doble si el instrumento que utiliza requiere volúmenes mayores a 1.0 mL.

1. Incube todas las celdillas a temperatura ambiente por 5 Minutos.

2. Lea S y U contra RB a 580 en un intervalo de 60 minutos. Control de calidad: En cada corrimiento de muestras se deb incluir un control de suero y/u orina ensayados ya sea por este método, fotómetro de flama o electrodo ión selectivo.

RESULTADOS

Los valores se pueden derivar por la siguiente ecuación:

Potasio en suero, plasma u orina (mmoI/L)=Au x 4

As

Orina Potásica (mmol/L x Volumen de 24 h (mL)

                                   1000

Donde Au y As son los valores de absorbancia de la muestra y

Estándar, respectivamente, y 4 es la concentración del estándar.

VALORES ESPERADOS

 Rango Normal: Suero 3.6-5.5 mmol/L

Plasma 3.5-4.8 mmol/L

Orina 26-123 mmol/24h (varía con la dieta).

TECNICA DEL CLORO

Fundamento:

Los iones de cloruro del seuro se titulan con una solucion valorada de nitrato de mercurio en presencia del indicador difenilcarbazona. Los iones Hg++ se combinan con los iones Cl- , el exceso de Hgque no reacciono con los iones clouros se combina con el indicador difenilcarbazona para formar un complejo de color violeta azulado.

Material:

·         Equipo para la toma de muestra

·         Perrilla para pipetear

·         Gradilla

·         Tubos de ensayo

·         Balanza analitica

·         Muetra: suero sanguineo

Reactivos:

1.       Solucion de difenilcarbazona (1mg/ml): Disolver 50 mg de difenilcarbazona en 50 ml de alcohol etilico, agitar y usar.

2.       Solucion de nitrato de mercurio (0.015N). pesar 3 gr de nitrato de mercurio monohidratado y disolverlos en 300 ml de agua destilada. Agregar inmediatamente 2.6 ml de acido nitrico y aforar a 1000ml.

3.       Agua destilada

4.       Solucion estandar para cloruros

Procedimiento:

Reactivos:	Estándar (100mEq/L):	Problema (paciente):
1-Suero	---------------	0.2 ml suero
2-Estandar de cloruros	0.2 ml de estándar	-----------------
3-Agua destilada	1.8 ml de agua destilada	1.8 ml de agua destilada
4-Difenilcarbazona	0.6ml	0.6ml
5-Nitrato de mercurio	Fracción de 0.01ml***	Fracción de 0.01ml***

***Mezclar y continuar añadiendo nitrato de mercurio hasta la aparición de color violeta azulado.

Calculos:

Concentracion de cloruros= volumen de Hg(NO3)2 utilizado para titular de la muestra (en ml)  X100

(en mEq/L)                   Volumen de Hg(NO3)2 utilizado para titular el estandar (en ml)

Valores normales de cloruros en suero. 96 a 16 mEq/L

TÉCNICA DEL FOSFORO INORGÁNICO:

El fosforo reacciona con el molibdato de amonio en presencia de acido sulfúrico para producir un complejo de fosfomolibdato no reducido. El incremento de la absorbancia a 340nm es directamente proporcional a la concentración de fosforo inorgánico en la muestra.

Recolección y preparación de la muestra:

La muestra de elección deberá ser un suero fresco, claro y no hemolizado. Las muestras podrán guardarse hasta 7 días a una temperatura de 2-8ºC y hasta por 6 meses a una temperatura de -20 a 0ºC.

Preparación del reactivo:

El reactivo de trabajo se prepara combinando los volúmenes iguales del reactivo de molibdato de fosforo y del reactivo catalizador del fosforo. Bien mezclado antes de usarlos.

Materiales:

·         Reactivo de trabajo.

·         Un anazador que sea capaz de leer la absorbancia con exactitud.

·         Cubetas de 1 cm o una celda de flujo que transmita luz a 340nm.

·         Tubos de ensayo del tamaño adecuado.

·         Pipetas del tamaño adecuado.

·         Agua des ionizada.

·         Un cronometro apropiado.

Procedimiento:

·         Prepare el volumen requerido de reactivo de trabajo de fósforo.

·         En tubos de ensayo por separado, pipetee 10 µL de agua des ionizada, estándar de fosforo o del suero a ser analizado.

·         Agregue 1.0 mL del reactivo de trabajo del fosforo y mezcle.

·         Incube la mezcla por 2 minutos a una temperatura de 18-26ºC, por un minuto a 37ºC.  Determine la absorbancia del estándar (As) y de cada suero (A) a 340nm utilizando la muestra de agua des ionizada como blanco de reactivo.

Cálculos & Resultados:

Fosforo en mmol/L (mg/dL)=  x concentración del estándar.

A= absorbancia de la muestra desconocida.

AS= absorbancia del estándar.

La concentración del fosforo inorgánico se expresa en mmol/L (mg/dL).

Valores esperados:

0.97- 1.45 mmol/L (3.0-4.5mg/dL). Se sugieren estos valores como referencia. Se recomiendan que cada laboratorio establezca el rango normal para el área en que esta localizado.